地区：上海市 宝山区
关键词：广西医科大学
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000003945
成果描述：
| 课题来源与背景：课题来源：该课题属广西科学研究与技术开发计划项目，合同编号：桂科攻1355005-3-2。课题背景：肝癌是全世界最高发的恶性肿瘤之一，中国也是肝癌的高发区。但是，肝癌的发病机制尚未完全清楚，其起病隐袭, 早期缺乏特异性症状, 确诊时大多数患者已达局部晚期或已出现远处转移, 只有约15%的患者适合手术切除，且术后易复发和转移严重制约了肝癌的疗效。对于失去手术机会和术后复发的晚期肝癌患者，药物治疗是最主要的治疗手段。但是，肝癌传统化疗药物最大缺点是缺乏组织选择性，在体内广泛分布，疗效差，且在发挥疗效的同时往往产生明显的全身性毒副作用，从而严重影响了治疗效果。因此,寻找疗效高而毒副作用小的新型抗癌疗法已成为肝癌治疗研究中的重点和热点。肝癌在其癌变增殖转移等一系列过程中伴随着不同阶段的癌基因或抑癌基因变异, 引起相关因子表达的紊乱，针对这些生物学特性, RNA干扰( RNA interference, RNAi)因其特有的高效性、特异性、低毒性, 为肝癌基因治疗的研究开辟了一条新的途径。RNAi不仅成为研究基因功能强有力的工具，而且在治疗病毒感染、肿瘤以及靶向药物研究中具有广泛的应用前景。肝癌的发生和发展是多因素、多阶段、多基因相互作用的结果, 包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因的激活和抑癌基因的失活、信号转导通路的异常、细胞的凋亡和增殖调节失控等。 课题组的研究和文献报道均证实尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）及其受体（uPAR）在肝癌的发生、发展及侵袭迁移中起重要作用。在课题组前期研究中发现uPA及uPAR的变化与肝细胞癌变密切相关，尤其在门静脉栓、肿瘤的侵袭和转移的病例中,uPA与uPAR过度表达与肝癌的演进、侵袭和转移密切相关。uPA及uPAR系统在肿瘤细胞侵袭迁移中发挥着重要作用。整合素（integrin）家族是uPAR信号通路中最重要的跨膜受体。由于uPAR缺乏跨膜结构和胞内段, 信号转导的实现必须有跨膜受体的参与, 因此，研究uPAR信号通路中的辅助受体与uPAR协同作用机制, 对阐明uPAR信号通路是十分必要的。组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)属半胱氨酸蛋白水解酶，能在酸性环境中分解蛋白质，刺激肿瘤细胞生长，参与肿瘤血管生成，溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织，还可激活uPAR。Cathepsin B和uPAR对细胞外基质的酶解相互联系、协同促进，其可能是由于Cathepsin B高表达诱导激活uPA，uPA 又上调uPAR 的表达，进而促进uPA介导的纤溶酶系统降解细胞外基质和基底膜的连续过程而导致侵袭与转移。uPAR和Cathepsin B相互关联、协同促进，在肝癌的发生、发展及侵袭迁移中起重要作用，然而，RNAi联合沉默uPAR和Cathepsin B基因靶向治疗肝癌尚未见报道。因此，通过RNAi沉默肝癌细胞的uPAR和Cathepsin B基因，研究其对肝癌的靶向治疗及机制，进一步探讨肝癌的发病机理，为肝癌治疗的新策略提供理论依据，具有重要的临床意义。技术原理及性能指标：技术原理：siRNA的合成。 细胞培养、siRNA转染SMMC-7721肝癌细胞。RT-PCR 检测uPAR和CathepsinB基因表达。Western blot检测uPAR和CathepsinB蛋白表达。MTT 法测定细胞增殖。FACS(fluorescence-activated cell sorting) 分析细胞周期。原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。Transwell细胞侵袭试验。免疫沉淀法和Western blot法分别检测uPAR、CathepsinB、MMP9、ERK、PI3K和Integrinα6蛋白表达。性能指标：uPAR和Cathepsin B siRNA转染7721细胞转染效率在低浓度siRNA的转染效率最高，可达85%，而且此时细胞的生长状态良好。 uPAR siRNA（A、B、C）和Cathepsin B siRNA（A、B、C）转染效率的鉴定，si-uPAR-C是uPAR基因的最佳沉默剂，si-CTSB-B是cathepsin B基因的最佳沉默剂。 uPAR siRNA-C和Cathepsin B siRNA-B联合沉默组沉默效果最佳。 细胞增殖的监测发现在24h节点si-CTSB 组和si-UC组的细胞增殖被明显抑制了，而si-uPAR组在48h节点被明显抑制。 Transwell侵袭实验显示单独和联合沉默uPAR 和 cathepsin B后，siRNA沉默能抑制癌细胞增殖，联合沉默效果最佳。流式细胞术实验显示单独或联合沉默uPAR 和 cathepsin B后，单独和联合沉默组细胞在细胞凋亡中晚期阶段明显增加，而联合沉默组增加最为明显。 细胞迁移能力检测：细胞划痕实验显示单独或联合沉默uPAR 和 cathepsin B后，单独和联合沉默组肿瘤细胞迁移能力下降，联合沉默组下降最为明显。 RT-qPCR检测结果显示：单独和联合沉默组肿瘤细胞Integrins α 6mRNA、MMP-9 mRNA明显下降，联合沉默组下降最为明显。 Western blot检测Integrinα6蛋白表达的结果显示：单独和联合沉默组肿瘤细胞Integrins α 6、p-PI3K 、p-ERK明显下降，联合沉默组下降最为明显。流式细胞术检测细胞周期显示：单独和联合沉默组肿瘤细胞G1期(合成前期)细胞明显增加，联合沉默组增加最为明显。发表论文：完成论文7篇，发表论文5篇，其中SCI期刊3篇，核心期刊2篇,硕士研究生毕业论文2篇。 培养研究生：培养了研究生4名。团队建设促进了该院肝癌研究团队的发展。技术的创造性与先进性：该课题首次研究了siRNA联合沉默uPAR和Cathepsin B基因对肝癌的治疗作用及其作用机制，探讨了肝癌靶向治疗的新策略和新技术。技术的成熟程度，适用范围和安全性：该项目的技术和方法成熟、稳定，安全性好，适用于肝癌的靶向治疗。应用情况及存在的问题：在区内外多家医院推广应用。历年获奖情况：无。 |
