地区：上海市 宝山区
关键词：广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000002646
成果描述：
| 课题来源与背景：“实验猴小肠结肠炎耶尔森氏菌和空肠弯曲杆菌多重分子信标环介导等温扩增检测技术研究”课题是国家质检总局下达给广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心的科研项目，项目编号为2013IK030。环介导等温扩增(LAMP)技术具有敏感度高，设备要求简单特点，其扩境产物检测经历了琼脂糖电泳、浊度法，SYBRGreen染料法、分子信标法发展阶段。琼脂糖电泳法费时费力且有污染，浊度法比较适合定量测定，肉眼观察敏感度较电泳染料法低一个数量级。SYBRGreen染料法可以用肉眼直观明了地准确判断，缺点是SYBRGreen染料对LAMP反应有抑制作用，必须反应完毕后开盖加入，易导致污染。分子信标法LAMP融合了LAMP法的敏感特异和设备要求简单优点和分子信标标记不同颜色的特点，可以在同一反应体系中进行多个项目的测定即多重LAMP。技术原理及性能指标：该研究在LAMP扩增过程中，茎环状扩增产物几何级倍增，分子信标选择性地与产物环状部分结合，分子信标的空间构型发生改变，猝灭基团与荧光基团分离，信标释放荧光信号。在同一反应体系标记有不同荧光信号的几种分子信标可以特异地与不同的扩增产物给合，发出不同的荧光信号，实现多重恒温扩增。方法准确性：不与沙门氏菌,志贺氏菌,大肠杆菌等常见的肠道菌交叉反应，无假阳性或假阴性。敏感性：敏感度与PCR相当，最低检出限不低于100cfu/ml。快速：检测时间少于1小时，检测时间较PCR法缩短1/3。干扰性：两种菌的检测特异性、敏感度、反应速度与单重LAMP分子信标法结果无显著差异。技术的创造性与先进性：创新一：在LAMP反应体系中加入分子信标，使新的反应体系同时LAMP扩增效率高和分子信标高特异性的优点。创新二：选用不同荧光素标记的小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲杆菌的分子信标，实现了LAMP双重扩增和检测。创新三：通过样品检测表明，信标-LAMP与传统LAMP、可视LAMP、PCR、荧光PCR等方法检测结果符合性高。信标技术的引入，扩展了LAMP应用功能，使LAMP具备多重荧光定量检测能力双，并且，信标-LAMP的敏感性高于传统的LAMP电泳法、浊度法、显色法，是LAMP技术发展的最新形式。技术的成熟程度，适用范围和安全性：LAMP技术与分子信标技术成熟而稳定，信标-LAMP技术是由两项技术融合创新而成，该技术处于试用阶段，试用结果证明其扩增效率高且实现了LAMP多重检测功能。信标-LAMP技术国内外鲜有报道，技术的可靠性还要进一步论证。该成果信标-LAMP技术可用于猴类小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲杆菌DNA筛查和定量测定，为该区实验猴两类人畜共患病菌的监测，提高该区实验猴品质提供可行的检测技术。信标-LAMP技术检测的标的是核酸，扩增产物也是核酸，不会增加病原菌传染、扩散风险，其生物风险性为零。信标-LAMP检测全程均在封闭反应中进行，正常情况气溶胶导致的DNA污染机率接近零。所以信标-LAMP有很高的安全性。应用情况及存在的问题：海南出入境检验检疫局技术中心、苏州VRL公司、广西玮美公司都试用了该课题提供的双重分子信标-LAMP试剂盒，对养殖场实验猴小肠结肠炎耶尔森氏菌和空肠弯曲杆菌进行疫病检测测，检测结果与荧光PCR符合性高。该研究成果受到较多的检疫技术工作者的关注并表现出了合作意向，但由于没有经费支持后续研究和推广，推广应用进展较慢，建议配套成果推广项目，使该成果较快发挥作用。 |
