地区：上海市 宝山区
关键词：宁波市鄞州区第二医院;温州医科大学;宁波市鄞州人民医院;宁波市鄞州区疾病预防控制中心
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000001500
成果描述：
| 该项目组是国内早期从事于肝细胞生长因子(HGF)研究的团队，历经14年，率先在分子水平、细胞水平和动物水平系统研究HGF及其抑制因子NK4对肿瘤细胞生长的调控机制，定量检测HGF mRNA在AL、淋巴瘤、CML的动态变化，评价其对恶性血液肿瘤的诊断、治疗和预后的临床价值。主要研究内容：HGF基因、NK4基因的克隆、重组质粒构建、真核表达和NK4蛋白的制备。HGF及其抑制因子NK4对细胞增殖、迁徙和侵润的生物学效应评价。HGF及其抑制因子NK4对肿瘤细胞凋亡的生物学效应评价。HGF对血管新生的生物学效应评价。HGF在恶性血液肿瘤的诊断、治疗和预后的价值评价。主要技术指标：HGF基因、NK4基因的扩增与克隆。HGF、NK4重组克隆载体和重组真核表达载体重组载体的构建。实时FQ-PCR定量检测HGF基因、NK4基因转染后的mRNA表达。WB、ELISA、免疫细胞组化等方法检测HGF基因、NK4基因转染后蛋白的表达。半固体培养法检测HGF、NK4对Raji细胞等肿瘤细胞生物学性状的影响。NK4基因重组表达载体的构建、重组蛋白表达的诱导条件优化、分离纯化、复性及活性鉴定。HGF基因、NK4基因的人淋巴瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立。HGF、NK4对转染后细胞的c-MET蛋白磷酸化及mRNA表达的影响。HGF、NK4对淋巴瘤移植瘤细胞的凋亡和血管形成的影响。FCM等检测HGF、NK4对细胞凋亡的影响。定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3、Caspase-12和Bax等mRNA表达的影响。HGF基因在HUVECs细胞的转染。FCM检测HGF对HUVECs细胞早期凋亡、活性氧自由基浓度的影响。检测HGF对HUVECs细胞血管新生的影响。定量PCR检测HGF基因转染后血管生长相关基因VEGF、KDR、MMP-ANGPT1等mRNA的表达。定量检测HGF mRNA在AL、淋巴瘤、CML诊治前后的动态变化。应用推广及效益情况：经浙江省人民医院等10家三级医院临床应用证实，定量检测HGF mRNA有助于恶性血液肿瘤的诊断、治疗和预后预测。上述结果有助于解释恶性肿瘤的发生、发展的生物学特征，提示存在一种新的分子机制。以所取得的研究成果作为切入点，将为恶性肿瘤的诊治提供新的观察指标和治疗措施，为进行细胞治疗、基因治疗及药物开发提供实验支撑。研究背景：中国恶性肿瘤发生率正处于快速上升期，恶性肿瘤防控已得到政府的高度关注，科技部第十二五计划首次将恶性肿瘤的预防列入其中。恶性肿瘤防治主张早发现、早诊断、早治疗，但恶性肿瘤疗效仍不理想，因此客观系统地阐明肿瘤发生的本质，拓展新的治疗手段与途径，有助于有效提高恶性肿瘤的疗效，降低死亡率。恶性肿瘤的治疗方法已获长足发展，但多数恶性肿瘤的疗效仍不理想，这可能与采用的治疗措施未能真正获得有效的切入点，尤其是未能阻断肿瘤发生发展的分子途径有关。细胞分化与增殖紊乱几乎是既往肿瘤发生机制研究的全部内容，现认为肿瘤发生往往同时伴有细胞增殖异常和细胞凋亡异常，将细胞凋亡纳入肿瘤的发病机制研究，可更客观系统地阐明肿瘤发生的本质，拓展新的治疗手段与途径的研究，以有效提高恶性肿瘤的疗效，降低死亡率。肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能的细胞因子，可激活c-Met/HGF受体酪氨酸激酶，增强HGF/c-Met系统的信号转导，发挥其生物学功能，主要表现为丝裂原、能动原、形态发生原效应。因此，阻断HGF/c-Met系统的信号转导可能成为抗肿瘤治疗的新策略之一。NK4作为一种生物活性分子，可有效抑制肿瘤细胞的增殖、迁徙和侵润，同时还具有抑制瘤内血管新生的作用。NK4生物学效应的发挥是通过与HGF竞争性结合HGF受体从而阻断HGF/c-Met信号转导途径而实现。HGF作为一种多功能的细胞因子，在肿瘤发生发展中的促增殖、迁徙、侵润和血管新生作用被确认，研究发现其还具有抗凋亡功能。若能证实NK4可全面抑制HGF生物学效应，则以此为切入点，可系统阐明HGF-NK4进行肿瘤生长调控的分子机制，结合基础研究与药物研发，为恶性肿瘤治疗提供新策略。技术创新内容：HGF水平检测有助于恶性血液肿瘤的诊断、治疗和预后预测，实验室诊断、血液及淋巴系疾病。HGF在AL呈高表达，无性别、年龄、类型差异；HGF表达水平与临床疗效的呈负相关性，表达水平越低获得的疗效越佳。在其他恶性血液肿瘤如淋巴瘤、慢性粒细胞白血病中也存在相似结果。该项目组最先报道HGF水平与恶性血液肿瘤诊疗的关联性。系统揭示HGF的促肿瘤效应的分子途径和调控机制，血液及淋巴系疾病、医学分子生物学。该项目于2001年开始，历经14年，首次通过HGF、NK4的蛋白作用和基因转染等途径在分子水平、细胞水平和动物水平系统评价了HGF、NK4对淋巴瘤等恶性肿瘤在细胞增殖、迁徙和侵润、凋亡与动物成瘤等影响，证实HGF可抑制凋亡的发生，促进肿瘤形成，而NK4是HGF的理想拮抗剂，可抑制肿瘤的发展，为恶性肿瘤的临床治疗提供实验基础。在研究内容方面，对于肿瘤发生发展的本质，既往研究着眼于细胞增殖，该项目同时将细胞增殖与凋亡纳入研究内容，在有助于全面阐述其本质的同时证实HGF、NK4的生物学效应；在研究策略方面，既往研究HGF、NK4相关研究或侧重于基因转染，或侧重于蛋白作用，该项目首次联合分子、细胞和动物等途径进行综合系统研究；在研究对象方面，除实体瘤外，首次纳入了仍为治疗难点的恶性血液肿瘤，该项目组最先就此作系统报道。项目组采用上述研究设计，首次系统分析了HGF、NK4的竞争性拮抗效应，保证了结果的准确性和完整性，系统揭示了HGF的促肿瘤效应的分子途径和调控机制。首次系统全面观察HGF的促血管新生效应，证实其在肿瘤发展、血管重建等方面的生物学作用，医学分子生物学。研究证实，HGF可促进人脐静脉内皮细胞迁徙、定向趋化、小管形成，拮抗早期凋亡的发生，从而促血管新生效应。成功构建了NK4基因的原核表达载体，转化后高效表达并成功制备NK4重组蛋白，医学分子生物学。项目组采用FQ-PCR、ELISA和Western blot技术进行NK4基因转染后表达筛选的同时，采用基因重组技术和蛋白质技术，构建原核表达载体pET-26b(+)-NK4，获得重组表达菌NK4-Rossete(DE3)/pET-26b(+)，优化表达后采用Ni-NTA树脂亲和层析法获得纯度达95%重组蛋白，并保留了其生物活性。NK4蛋白的成功高效制备解决了NK4研究的无商品化制剂提供的主要制约，同时有助于进行定量研究，保证了结果的可靠性、可比性。国内外同类技术的主要参数比较：该项目采用分子生物学、细胞生物学、免疫组化、动物造模等技术，如细胞培养、基因克隆、基因转染、实时FQ-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA等，在分子水平、细胞水平到动物水平首次系统研究了HGF、NK4的促肿瘤效应及其分子调控机制，涉及的主要技术指标全面而系统，包括基因克隆、扩增、重组、转染、表达、重组蛋白制备、动物模型、细胞凋亡、蛋白磷酸化、mRNA定量检测及活性氧自由基浓度、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-12、Bax、VEGF、KDR、MMP-9、ANGPT1等，国内外尚未见相似系统报道。同时，经浙江省人民医院等10家三级医院临床应用证实，定量检测HGF mRNA有助于恶性血液肿瘤的诊断、治疗和预后预测，具重要的临床意义。经文献检索对比，项目组最早将HGF mRNA应用于急性白血病、淋巴瘤和慢性粒细胞性白血病等恶性血液肿瘤的临床诊治，提示HGF可作为一种新的观察指标并证实有应用推广价值。该项目组最先进行临床应用与效果评价，并建议将HGF纳入恶性血液肿瘤的诊疗观察指标。上述结果有助于从一种新的潜在的分子途径阐述恶性肿瘤的发生、发展的生物学特征，明确HGF在恶性肿瘤治疗、血管重建等领域的潜在价值，为进行细胞治疗、基因治疗及药物开发提供实验支撑，将为恶性肿瘤的诊治提供新的观察指标和治疗措施，提示HGF在恶性肿瘤的防治领域具有潜在的应用前景。综上，国内外尚无关于HGF促肿瘤效应的相似系统研究报道。 |
