地区：上海市 宝山区
关键词：上海市儿童医院
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000001340
成果描述：
| 通过转基因动物生产高附加值重组药物蛋白是继微生物发酵和哺乳动物细胞培养技术之后发展起来的新一代生物制药技术，已成为国际上生物技术研发与产业的热点和前沿，但其技术难度大，成功率低。该项目建立和发展了一整套转基因牛、羊研制的新技术体系，有效提高了转基因动物研制的效率，获得了一批有开发价值的转基因动物，引领了中国转基因动物新技术的发展。创建了通过整合胚移植制备转基因动物的技术路线该项目采用原核显微注射把外源基因表达载体注入受精卵后，经体外培养到囊胚，取1-2个细胞进行分子检测，选取整合外源基因的阳性囊胚进行移植，大大减少了所需受体动物数量，提高了转基因效率。此外，该项目采用山羊胚胎非手术移植技术，减少了对受体母羊的损伤，使受孕率明显提高。应用上述新技术路线，获得了在乳汁中表达人凝血因子IX的转基因山羊和携带人血清白蛋白基因的试管牛，该项成果先后被评为1998年和1999年“中国十大科技进展”。创建了“同体克隆”和“同型克隆”技术，大幅度提高了转基因克隆牛的研制效率该项目发明了牛“同体克隆”技术(即采用来源于同一个体的体细胞和卵母细胞进行核移植)，其囊胚发育率显著高于体细胞-卵母细胞来自不同个体的“异体克隆”(38％vs 23％)，克隆牛出生率也由原先的5.6%提高到23.1%，效率提高了4倍多。应用PCR-RFLP的方法鉴定出牛的4种主要线粒体DNA单倍型，创建了“同型克隆”技术，证明当供核细胞与卵母细胞线粒体单倍型一致时，克隆胚胎囊胚发育率明显高于单倍型不一致的组合(39.4% vs 26.3%)。当“同型克隆”技术应用于异亚种(奶牛-黄牛)克隆时，同样获得较高的效率，提高了转基因牛生产的实用性。实验研究发现“同型克隆”胚胎的组蛋白H3K9的甲基化和多能基因启动子的甲基化水平更接近正常牛，揭示了克隆胚核质间的线粒体相容性对克隆胚胎的发育产生显著的影响。建立了phiC31整合酶介导的外源基因定点整合系统首次在牛基因组中鉴定出phiC31整合酶识别的假attP位点，深入研究了其序列特征，发现BF4为高整合和高表达热点。联合利用phiC31整合酶系统和同源重组技术体系，将BF4旁侧序列引入目的基因载体中，实现了外源基因的定点和高效整合,为提高转基因动物的整合和表达率提供了新的技术体系。该项目获得授权发明专利10项；发表了33篇研究论文，其中SCI收录19篇；应用上述技术先后获得了整合人血清白蛋白、人凝血因子IX、人促血小板生成素和人转铁蛋白等多种基因的转基因牛，并在牛乳中高水平表达人凝血因子IX(600mg/L)、人促血小板生成素(200mg/L)和人转铁蛋白(10g/L)，具有产业开发价值。技术推广应用到上海、河北、新疆等地，在国内外产生了较大的影响，为中国转基因动物技术的发展做出了积极的贡献。 |
