地区：上海市 宝山区
关键词：凭祥出入境检验检疫局综合技术服务中心
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005477
成果描述：
| 任务来源及背景：广西检验检疫局科技计划项目，项目名称，用TaqMan探针实时荧光PCR法快速鉴定瓜实蝇，项目编号2011K013。长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态学的特征而确定的，由于生活环境不同，实蝇族昆虫形态特征，如斑纹、颜色等随之发生相应的变化，给鉴定带来困难甚至错误。在瓜果蔬菜的检疫中，常常获得的是实蝇的幼虫和卵，而实蝇幼虫很难用常规方法鉴定到种，而将幼虫和卵饲养到成虫再进行种类鉴定，需要较长的时间，影响到口岸检疫的运行速度和检疫质量，迫切需求建立一套快速、准确、切实可行的实蝇检测技术。技术原理及性能指标：通过检测特异性荧光探针结合到特异性扩增产物后水解发出的荧光，以检测DNA特异性扩增量。根据达到荧光阈值的循环数，即可判断检测目标的阴阳性。设计出了瓜实蝇探针法实时荧光PCR检测的特异性引物Bacqf：5’-CAGCTATTCCATACTTAGG-3’，Bacqr：5’-GGTGAAGAATCGAGTAAG-3’，以及特异性探针ProBac：5’-FAM-CGTTGTCAACAGCGAATCCTCC-TAMRA-3’。该研究建立了瓜实蝇快速鉴定的方法：受检虫体提取基因组DNA，三步法扩增，通过Ct值判断检测结果，Ct值<30为阳性，Ct值>30为阴性。该方法能够高效的将任何虫态的瓜实蝇(或其残体)与其近似种进行区分，大大地缩短了检测时间。技术的创造性及先进性：通过该研究，首次利用分子生物学的方法，通过TaqMan探针法实时荧光PCR对将瓜实蝇与其近似种进行了区分，实现了对瓜实蝇的分子鉴定。该研究通过综合试验所有样本测定的序列和Genbank中已发布的序列，根据cytb mtDNA区域中的保守序列，设计特异性引物和探针，经检测其特异性和检测灵敏度均能达到实用要求。技术的成熟程度，适用范围和安全性：该研究只设计了针对瓜实蝇的鉴定引物及探针，因此，对其他实蝇的鉴定还需要进一步完善试验数据，并使用更多样本检测该研究所采用引物的特异性和检测效果。该技术具有安全、快速、高效、准确的特点。应用情况及存在问题：该研究属于应用研究的初步研究阶段，尚未推广应用。但该研究所采用的方法具有简单易行、快速高效的特点，可以肯定具有良好的推广应用前景。虽然该研究使用了不同种和不同时间的同种的样本进行试验，而且综合了Genbank数据库里已经发表的序列信息，但由于果实蝇属种间、种内遗传关系的复杂性，该研究还需要进一步完善试验数据，使用更多样本检测该研究所采用引物的特异性和检测效果。同时，虽然该研究所采用的方法简单易行、快速高效，但由于不是所有的口岸实验室都具备进行实时荧光PCR实验的条件，同时探针法实时荧光PCR的费用也相对较高，因此推广应用上也有一定局限性。 |
