地区：上海市 宝山区
关键词：杭州市疾病预防控制中心
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005074
成果描述：
| 无菌性脑炎是严重的中枢神经系统非细菌性感染。据报道在已经确定病原的无菌性脑膜炎病例中，肠道病毒占40%～80%，其中埃可病毒占了80%～90%[1]。埃可病毒9型(简称ECHO-9)是引起儿童夏季无菌性脑炎最常见的病原体之一。ECHO-9病毒由呼吸道或口腔至消化道侵入局部粘膜，与宿主细胞蛋白受体结合，数分钟内即完成插入，脱衣壳和释放RNA基因入宿主细胞质中，进行装配和复制。ECHO-9病毒在上皮细胞以及咽部或肠壁淋巴组织居留和增殖，可由此从口咽分泌物或粪便排出，并可由原发病灶经淋巴通道扩散至局部淋巴结以及血液循环至其他器官，如中枢神经系统、皮肤粘膜、心脏、肺等，在该处增殖，引起各种病变。死亡者均系重症患者。ECHO-9病毒引起的无菌性脑炎暴发在美国、加拿大、英国、欧洲、日本、韩国等地均有报道[1-2]。在1953年一位健康儿童的肛拭子首次分离到ECHO-9 Hill原型株，发现对新生小鼠没有致病性[3]。在1957年从一位无菌性脑炎患儿的脑脊液中分离到ECHO-9 Barty原型株，能引起新生小鼠肌肉损伤麻痹瘫痪。1989年Takaya TANAKA报道了由ECHO-9感染引起横纹肌溶解导致急性肾衰的一病例研究。1993年M A Zuckerman[5]报道了一例9个月龄患儿ECHO-9脑炎急性死亡病例。在中国2005年山东和2000年云南等都有分离到ECHO-9病毒(GenBank中有基因序列证据)。有报道2009年7月-10月宁夏回族自治区吴忠市同心县发生一起由ECHO-9所致病毒性脑膜炎的暴发。根据2006年卫生部《人间传染的病原微生物名录》，埃可病毒属于危害程度第三类的病原微生物。轻者表现为上呼吸道感染症状，重者可以表现为无菌性脑炎、糖尿病及横纹肌溶解导致急性肾衰等症状，也可短时间引起患儿死亡。在2010年6月中旬杭州地区的建德市某幼儿园也发生了一起由ECHO-9所致病毒性脑膜炎的疫情。在国内病毒性脑炎发病率较高，但报道ECHO-9引起的病毒性脑炎较少，这可能与没有快速有效检测ECHO-9的方法有关。国内对ECHO-9的病原学、流行特征及主要传播途径还有待研究，国际上对ECHO-9的病原学检测主要采用病毒培养，血清中和试验或者RT-PCR扩增目的基因条带，然后进行基因测序，在GeneBank网站进行Blast比对来确定埃可病毒的型别。这些方法共同的不足是费时、费力、不能高通量检测，而且对实验人员及仪器设备的要求比较高、成本较大，不能在基层实验室进行。因此对ECHO-9快速检测方法以及流行病学的研究非常重要，这不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对突发疫情早发现、早干预，保障人民群众健康起到至关重要的作用。该研究根据GenBank登录的ECHO-9毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在VP1基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性。TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法建立：引物与探针最佳浓度优化：为防止TaqMan荧光定量RT-PCR反应混合物中由于引物与探针之间的浓度不当而引起非特异性竞争抑制，选择引物与探针的最佳浓度配比。试验在相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，选用不同浓度范围的引物和探针，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。Tm温度的优化：在同一浓度阳性核酸为模板条件下，采用荧光定量PCR仪上的温度梯度功能，在Tm值(45～65℃)下进行检测，选择最佳Tm温度。荧光定量RT-PCR方法建立：选用一步法荧光RT-PCR Kit(宝生物工程公司)，试剂代码DRR064A，反应体系20μL，每个反应管中各种试剂加样量分别为2倍缓冲液10μL，100nmol/L引物各0.4μL，200nmol/L探针0.4μL，逆转录酶混合物0.4μL，聚合酶0.4μL，模板RNA5μL，用水补足至20μL。反应条件为逆转录42℃15min，95℃热启动30s，45次PCR循环为95℃5s→55℃30s。同时对疑似埃可病毒9型病例临床标本进行检测。证实该方法有高度的特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达10TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。该研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测埃可病毒9型特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。根据该课题组以前在GenBank发表的ECHO9VP1序列(KC182534)，委托上海生工进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列。和质粒pET28a(+)表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：5′-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3′(上游引物，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG)；5′-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCT TGG-3′(下游引物,含XhoI酶切位点)重新合成的ECHO9 VP1序列和pET28a(+)原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切。T4连接酶连接后，将产物转入E.coli DH 5α中培养，挑取单克隆进行PCR，酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒命名为pET28a-VP1。采用原核表达系统，高效表达ECHO9 VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有6个组氨酸的特点，使其得到有效的纯化和鉴定。用纯化的VP1蛋白免疫兔子制备的多克隆抗体，结果表明能特异性结合VP1蛋白。实验结果表明该纯化的重组蛋白具有较好的抗原性，可以作为间接ELISA诊断抗原使用。病毒中和试验表明该重组蛋白免疫兔子所得的抗体对ECHO9病毒有中和作用，能遏制病毒对RD细胞的侵袭。结果表明重组VP1蛋白具有很好的免疫原性和反应原性，可以作为候选疫苗。该研究还将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板，优化ELISA的试验条件，建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO-9的IgM和IgG方法。运用上述建立的两种方法对杭州地区儿童的ECHO-9引起病毒性脑炎流行情况进行了初步调查。分别完成对健康儿童人群ECHO-9感染率调查，及患病儿童ECHO-9感染率调查。标本来自2011-2013年杭州市手足口监测标本940份、2011-2013年浙江省儿保流感监测标本2006份。杭州地区2012年风疹、麻疹IgM抗体检测均阴性的发热儿童的血清176份及健康体检儿童的血清240份。分子生物学和血清学调查结果发现健康儿童人群及患病儿童的ECHO-9感染率均较低，患病儿童存在埃可病毒其它型别的感染如ECHO-30、ECHO-6。 |
