地区：上海市 宝山区
关键词：广西壮族自治区兽医研究所
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000004809
成果描述：
| 项目来源与背景：《水牛结核病检测与综合防制技术的研究和应用》为广西科技攻关项目，合同号为：桂科转0626001-5-1。项目由广西壮族自治区兽医研究所承担完成。中国水牛总数达2200多万头，居世界第二位。广西水牛418万头，占全国总数的19.07%。近几年，广西大力发展奶水牛养殖。牛结核病是一种人畜共患的传染病，在牛群中一直存在，人结核病中30%是由牛结核引起。中国没有奶水牛结核病检测标准，现有检测标准不适合奶水牛检测，而且缺乏有效的快速检测方法。技术原理及性能指标：LAMP检测方法的技术原理：利用6种特异引物，依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使链置换DNA合成在不停地自我循环。是一种简便、快速、灵敏、成本低廉的新型核酸扩增技术。荧光定量PCR检测方法的技术原理：在待扩增区域结合上DNA探针，PCR过程中，具有5→3外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量，具有扩增快速、灵敏度高和特异性强等优点。PCR及多重PCR检测方法的技术原理：于一个PCR反应体系中加入一对或多对特异性引物，在DNA聚合酶催化下，可同时扩增一个或多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率和节省珍贵的实验样品的优点。性能指标：项目合同要求达到的性能指标：研制出有自主知识产权的一整套PCR方法快速检测奶水牛结核病的技术；通过系统分析比较PCR检测、分离培养、结核菌素和临床病变等检测方法的符合率；对该区2千头水牛进行牛结核病检测；项目完成后将发表论文2-3篇。实际达到的性能指标：测定了奶水牛的皮厚与注射结核菌素后的皮厚差，奶水牛的平均皮厚是黄牛2.28倍、黑白花2.38倍。注射结核菌素后奶水牛的平均皮厚差是黄牛4.25倍、黑白花4.92倍，证实不同品种牛的变态反应敏感性与皮厚成正相关的关系，现有牛结核病检测标准不适合水牛检测；建立了能同时检测鉴别奶水牛结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR技术；建立了SYBR GREEN I荧光实时定量PCR检测奶水牛牛分枝杆菌的技术；建立了环介导等温可视扩增(LAMP)检测牛分枝杆菌的技术；序列分析了广西两株牛分枝杆菌MPB70、HSP65、ESAT-6基因序列，建立了数据库；比较了四种检测牛结核病方法的符合率，γ-干扰素方法和PCR方法有较好的符合率；完成了对广西水牛10200头的检测；发表论文13篇。培养了2名硕士研究生。技术的创造性与先进性：在国际上首次系统对奶水牛的平均皮厚、皮厚对变态反应的影响、结核菌素检测的用量和范围进行系统研究分析。水牛皮厚是黄牛、黑白花奶牛的2.2倍以上；注射牛结核菌素后水牛的平均皮厚差是黄牛和黑白花奶牛的4.25倍和4.92倍，水牛结核菌素检测用量为2千单位。其检测结果分析证实了奶水牛的变态反应敏感性与皮厚成正相关。为下一步制定奶水牛结核病检测提供数据。填补了国内外奶水牛这方面的技术空白。首次通过对阳性水牛剖检、病原分离鉴定和样品检测证明牛皮内变态反应检测方法检测水牛结核病特异性不高，假阳性多，再次验证了现有牛结核病检测标准不适合检测水牛，有必要采用一种以上的检测方法进行确诊。自主创新建立了6种牛结核病病原的分子生物学检测方法。其中，在国际上首次建立了4种，填补了国内外牛结核病快速检测技术空白。首次建立广西牛分枝杆菌流行菌株MPB70、HSP65、ESAT-6基因的遗传多态性数据库。有助于课题组了解跟踪牛分枝杆菌菌株的变异情况，为建立牛分枝杆菌检测方法提供数据，填补了这方面的国内外的技术空白。首次系统比较了四种检测方法对牛分枝杆菌的检测结果符合率，并提出临床应用指导意见。在国内外首次制订牛结核病的PCR检测方法广西地方标准，标准号DB45/T 465-2007，填补中国检测牛结核病地方标准的空白。首次制定奶水牛结核病综合防制技术规范“牛结核病检测+阳性扑杀淘汰+补充检测+繁育健康牛群+全程监测牛结核病”并在广西不同牛场推广应用检测牛6万多头，减少经济损失4000多万元，推广应用效益显著。申请国家发明专利1项，发表论文13篇。技术的成熟程度，适用范围和安全性：该项目研究建立的分子生物学快速检测诊断牛结核病技术是十分成熟的一项技术，具有快速、特异、敏感的特点。通过特异性检测病原核酸，来实现对牛结核病的快速鉴别诊断，安全性好。应用情况及存在的问题：水牛结核病防控是关系到人类生命安全的头等大事，单靠制订综合防制措施还远远不够，还需要投入大量的人力和资金，通过培训和提高人员防范牛结核病的意识，加大对饲养场的防控和监测力度，特别是散养户的监测，这样才体现该研究的实在意义，最终确保无牛结核病的奶水牛能健康发展。 |
