地区：上海市 宝山区
关键词：广西医科大学
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005730
成果描述：
| 肺癌是20世纪中国发病率和病死率发展最快的一种恶性肿瘤，也是危害该区人民健康的主要疾病之一。MMP、TIMP、VEGF、survivin等基因是公认对肺癌的侵袭和转移作用最大的几种调控基因。该研究通过应用免疫组化、PCR以及组织芯片等分子生物学技术检测影响肿瘤侵袭及转移的MMP、TIMP、VEGF、survivin等基因的表达情况，从分子层面对广西壮族肺癌的侵袭和转移进行研究，寻找广西壮族肺癌的侵袭和转移的分子生物学规律，为运用分子生物学技术预防和治疗广西壮族肺癌患者提供依据。收集广西医科大学第一附属医院2007年9月至2010年5月手术切除的NSCLC新鲜标本80份，术前未经化疗或放疗，术后均经病理证实，其中男51例，女29例。按照1997年UICC的肺癌国际分期，早期(I、II期)48例，晚期(Ⅲ、Ⅳ期)32例;病理类型:鳞癌29例，腺癌51例;肿瘤细胞分化程度:分化好49例，分化差31例;有淋巴结转移33例，无淋巴结转移47例;有吸烟史47例(29例吸烟指数≥400，18例吸烟指数≤200)，无吸烟史33例。取其中40例距肿瘤边缘5cm以外并经术后病理检查证实无癌细胞浸润的正常肺组织做对照。采用RT-PCR技术检测MMP、TIMP、VEGF、survivin等基因的表达水平。按照Trizol试剂说明书，分别提取肺癌组织和癌旁组织的总RNA。参照M-MLV逆转录包装盒说明书进行逆转录反应，合成的cDNA放置于-20℃贮存备用。以cDNA为模板，设计并合成好个基因的相应的上下游引物，调整反应条件和反应时间后进行扩增。构建的反应体系为25μl，在此之后，反应的产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察目的条带。在分析比较完目的条带后，为增加结果的可信度，课题组取出凝胶中的目的条带，送检进行目的条带的测序。北京诺赛基因组研究中心有限公司对反应产物进行测序，测出的序列在PUBMED上比对后证实为目的产物。在此之后课题组对收集到的样本进行了组织芯片以及免疫组化检测分析。免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司，组织阵列仪购自美国Beecher Instruments公司，所选载玻片为德国MenzelGlaser公司产品，已经去除DNA酶和RNA酶、在多聚赖氨酸溶液中浸泡包被1min,在45℃烤箱内烘干。课题组设计了共108点长方形阵列图，每张阵列图包含了NSCLC组织、癌旁组织和正常组织。在病理科老师的指导下复查每例标本的HE切片，在镜下选取肿瘤组织富集区域，在HE切片所对应蜡块的相应部位做好标记。将德国莱卡蜡和美国进口蜡按49:1的比例混合，经3次沉淀除去杂质后，制成受体蜡块。按照预先设计好的阵列图用美国Beecher阵列仪在受体蜡块上打孔。(直径2mm,间距2mm ,深度大约为2mm)，然后在供体蜡块上钻取选定组织注入受体蜡块相应部位该操作重复进行，直到108点均有组织芯为止。将芯片蜡块有组织的一面倒放在干净的载玻片上，放入37℃恒温箱中，15min后取出，用载玻片轻压蜡块，使芯片蜡块有组织的一面保持平整;在准备切片前，先将蜡块在50℃下过夜，进一步使组织芯和受体蜡块融合;自然恢复空温后,4℃过夜;3-4μm切片，捞片水温控制在45℃左右，尽量保持片子捞正;捞片后立即将切片置于58℃下过夜，以备后期实验。切片裱于玻片上，封蜡，4℃保存。采用SP法进行免疫组化染色。一抗包括各基因的免疫组化试剂盒，肺良性疾病肺组织作对照。染色结果阳性判断标准为胞浆内出现棕黄色颗粒，按阳性细胞所占比例百分数:＜10%为阴性，＞10%为阳性。该项目的实验结果表明，在非小细胞肺癌组织中MMP、TIMP、VEGF、survivin等基因表达水平均高于癌旁肺组织(P值均小于0.05)。并且MMP、TIMP、VEGF、survivin等基因在非小细胞肺癌组织中的表达均与患者年龄、性别、有无吸烟史、病理类型无关（P均大于0.05），而这些基因在非小细胞肺癌组织中的表达均与肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期有关(P均小于0.05)。该项目组现已发表该项目相关文章共9篇，国内核心期刊上发表论文7篇，（其中3篇为广西医学，1为微创医学、2篇为广西医科大学学报，1篇临床新医学，2篇广西医学会第五届胸心血管外科学术年会论文汇编），仍然有三篇文章在投。该项目共培养硕士研究生3名。 |
