地区：上海市 宝山区
关键词：广西大学
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005405
成果描述：
| 课题来源与背景：来源：国家自然科学基金项目“新型延胡索酸酶基因的异源高效表达和突变研究”;项目编号：31060016。背景: L-苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种优良的酸味剂和保鲜剂，在国际上公认为安全性食品添加剂，在医药工业、印染和烟草行业上有特殊的用途。近年来，包括西方发达国家在内的消费者对化学合成产品普遍持谨慎和怀疑态度，因此微生物发酵生产天然L-苹果酸的应用范围在迅速扩大。但是应用于工业化生产的主要是化学合成法等。而微生物合成转化技术相对于化学合成法来说，具有“反应条件温和、工艺简单、对环境友好、安全”等优势。当今应用于生产L-苹果酸的微生物主要有Brevibacterium ammoniagenes、Escherichia coli、Corynebacterium egvi、Microbacterium flavum、Saccharomyces cerevisiae等。利用微生物技术虽优于化学合成法，却存在产量低、周期长、品质不稳定等缺陷。因此，提高现有菌种延胡索酸水合酶的活力，或者分离编码新型延胡索酸水合酶的基因，构建高效的基因工程菌消除天门冬氨酸转氨酶的干扰具有重要的实践意义。研究目的与意义：该项目以新型延胡索酸酶FumF为研究对象，建立目标蛋白的分子遗传操作系统，完成目标基因高效表达系统的构建。通过纯化蛋白，利用LC-MS技术完成酶的功能研究；完成酶的相关动力学参数描述；通过对突变酶库的分离筛选，得到酶活更高或者其他酶活性更好的突变酶；完成相关突变酶的功能研究。通过比较突变酶和FumF蛋白之间的功能差异，推导相关氨基酸残基的作用，解析保守区域氨基酸残基的突变对酶功能的影响；初步阐述新型延胡索酸酶结构和功能之间的关系。通过对新型延胡索酸水合酶结构和功能之间的关系研究，特别是对关键保守氨基酸残基的突变研究，不仅可以为抗虫类药物的设计提供非常优秀的靶标；更为重要的是为能够分离酶活力更高的，或者其他酶活性更好的突变酶提供模式参考。主要论点与论据：该项目拟通过对新型延胡索酸酶fμmF基因在大肠杆菌系统中的高效表达和功能研究，重点解析相关氨基酸残基的突变对酶功能的影响，初步阐述新酶结构和功能之间的关系。通过该研究，分离酶活更高的或者其他酶活性更好的突变酶，拟着重解决实际应用中延胡索酸酶活力不高，受天门冬氨酸转氨酶干扰的关键科学问题。通过该项目的实施，将为上述科学问题的解决提供新的思路和另外的可选择解决方案。创见与创新：该项目以新型延胡索酸酶FumF蛋白为研究对象，通过研究新型蛋白的功能，拓展人们对未培养微生物功能基因的挖掘和认识。国际上鲜见有关来自于未培养微生物的延胡索酸酶基因资源开发利用方面的报道。该项目构建新型延胡索酸酶FumF蛋白的遗传操作平台，尝试构建起fumF酶基因的高效异源表达系统，对目标蛋白的功能进行解析；通过突变酶的功能解析，研究相关保守区域氨基酸的突变对酶功能的影响；初步阐述新酶的空间结构和功能之间的关系。fumF酶基因的高效表达和突变研究将对构建高效的基因工程菌奠定坚实的基础，将为解决实际应用生产中提高延胡索酸酶的活性、消除天门冬氨酸转氨酶的干扰这一瓶颈问题提供新的选择和理论参考模式。社会经济效益，存在的问题：该项目研究主要体现在理论上的科学指导意义。筛选高活性的延胡索酸水合酶菌株，或者构建高效的基因工程菌，解决工业中发酵生产L-苹果酸工艺中的瓶颈问题，一直是微生物学者关注的热点。利用宏基因组文库技术开发环境新型酶基因资源将为工业用酶制剂的研发开辟另外一条选择道路。从自然环境中分离筛选高活性的延胡索酸水合酶应用于发酵产L-苹果酸，应用领域广泛，潜在的经济社会效应较大。开展该课题的研究，不但可以拓展人们对未培养微生物功能基因的挖掘和认识，而且对于解决实际生产L-苹果酸工艺中，延胡索酸水合酶活性不高、易受工业菌种本身分泌的天门冬氨酸转氨酶干扰等瓶颈问题具有重要的参考价值。历年获奖情况：1.2012年广西壮族自治区自然科学研究优秀论文二等奖“未培养微生物新型β-葡萄糖苷酶的鉴定和生化性质研究Biochemical characterization of two novelβ-glucosidase genes by metagenome expression cloning”；获奖人员：蒋承建，李双喜，罗奉奉，金科，王琴，郝振宇，吴兰兰，赵高超，马格非，申佩弘，唐咸来，武波；授奖单位：广西壮族自治区科学技术协会；奖授年：2012年.证书编号：Ⅱ-2012-012.成果简介：该研究采集中国广西北部湾某海域海水，构建了一个宏基因组质粒文库。基于序列特异性筛选的策略分离得到了一个新型延胡索酸水合酶基因(fumF)。氨基酸序列分析揭示FumF蛋白和来自于Bacteroides sp.2_1_33B和Parabacteroides distasonis ATCC 8503的延胡索酸水合酶具有26%的一致性和43%的相似性。HPLC实验结果证实了纯化的重组FumF蛋白可以催化延胡索酸与水的水合生成L-苹果酸。在pH 8.5和55℃条件下，添加5mM的Mg<'+2>，FumF蛋白具有最大的催化活性。FumF蛋白显示了与底物良好的亲和性和较高的催化效率：在最适条件下，Km为0.48 mM,Vmax为827μM/min/mg,kcat/Km为1900 mM/s。DNA定点突变实验结果推测氨基酸位点A163、H170和V347对于FumF蛋白的最适作用温度和pH值以及热稳定性是必需的。利用DNA随机突变技术构建分离得到了一个可能包含延胡索酸还原酶frd1A新基因的突变克隆pGXAR313并完成了新基因的生化功能鉴定研究。序列分析比较结果揭示可能的新的基因frd1A和相关延胡索酸还原酶蛋白具有较近的进化关系。HPLC功能鉴定研究揭示Frd1A蛋白可以催化延胡索酸还原为琥珀酸。该酶的最适pH为7.0，最佳作用温度为28℃。Zn2+和Mg<'+2>可以刺激酶活的提升。在最适反应条件下，Frd1A蛋白的催化表观动力学参数为：Km= 0.227 mmol/L,Vmax= 29.9 U/mg,kcat/Km=5.44×104 per mol/s。新型延胡索酸酶基因的克隆和相关突变蛋白的鉴定研究显示了来自于环境宏基因组新蛋白的研究价值。 |
