地区：上海市 宝山区
关键词：广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005401
成果描述：
| 课题来源与背景：该课题由国家自然科学基金委于2010年下达的广西自然科学基金《龙眼酶促褐变底物结构、特性及变化规律研究》，合同编号：2010GXNSFC013010，实施年限为2010年3月–2013年3月。课题由广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所承担实施。研究目的与意义：龙眼是经济价值较高的南方名果，广西龙眼栽培面积与产量居全国前列，为该区农业支柱产业之一。随着该区龙眼总产量连年提高，销售压力不断增大，造成果农“丰产不丰收”，严重制约产业发展。采后果实褐变极大地限制龙眼贮运保鲜，国内外研究发现，龙眼果实采后褐变与多酚氧化酶(PPO)催化酚类物质氧化和形成褐色物质有关，但对龙眼果实采后酶促反应系统中PPO内源底物(即褐变底物)的化学结构鉴定，褐变底物在果实贮藏期间的氧化、聚合特性，酶、自由基、抗氧化剂等与褐变底物的作用模式，抗褐变剂对底物氧化、聚合反应的影响，不同品种龙眼褐变底物含量的差异等方面未见报道，需要系统研究。主要论点与论据：采后龙眼果皮中PPO及其底物的提取和纯化利用硫酸铵分级沉淀、透析、凝胶层析及离子交换层析技术建立并改进了龙眼果皮中PPO的提取纯化工艺，确定了龙眼果皮PPO粗酶液的酶活力单位为148000 U、蛋白含量为100mg蛋白/mL。利用95%乙醇重复浸提、有机溶剂连续萃取、聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析技术提取分离龙眼果皮PPO内源褐变底物，确立了标准工艺流程。解决了龙眼果皮中PPO内源褐变底物的提取纯化及制备关键问题。褐变底物的化学结构鉴定：利用三氯化铁酚类特异性显色反应和胞外酶促褐变反应筛选龙眼果皮PPO内源褐变底物，并通过电喷雾质谱(ESI-MS)、紫外-可见光谱、比旋光度和核磁共振(1H NMR和13C NMR)等波谱分析技术确立了重要褐变底物结构鉴定的标准方法。该项目已分离纯化出“石硖”与“储良”龙眼果皮PPO的直接底物，通过波谱分析其结构鉴定为(-)-表儿茶素(Epicatechin)，在采后常温贮藏期间该底物含量呈下降趋势；龙眼果皮乙醇浸提液经有机溶剂连续萃取发现多酚类化合物主要存在于乙酸乙酯相，乙酸乙酯萃取物在柱层析分离纯化后经波谱分析鉴定出3个含量较高的重要化合物，即没食子酸(Gallic acid)、柯里拉京(Corilagin)和鞣花酸(Ellagic acid)；鞣花酸不是酶促褐变底物；没食子酸和柯里拉京溶液均可与龙眼PPO发生酶促褐变反应，确定两者是内源酶促褐变底物；在龙眼采后衰老过程中，随着果皮细胞生物膜系统的破坏，PPO与内源褐变底物细胞内区域化分布格局被打破，酶与底物接触发生催化氧化反应形成褐色物质，从而引起果皮组织褐变。通过比较褐变底物间的化学结构差异，尤其主要基团的异同，确定了龙眼果皮中重要的褐变底物没食子酸、柯里拉京与直接底物(-)-表儿茶素结构相近，均有PPO催化的关键结构：邻位酚羟基。(-)-表儿茶素为邻位二酚，没食子酸为邻位三酚，柯里拉京为邻位三酚聚合物。褐变底物在果实贮藏期间的氧化、聚合特性：酶动力学分析表明褐变底物(-)-表儿茶素与龙眼果皮PPO具很强结合力，反应活性最强，该酶促反应最适温度为25℃、最适pH为6.5，PPO抑制剂L-抗坏血酸、L-半胱氨酸完全抑制该酶促反应，其次依次为1,4-二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、EDTA-2Na，金属离子Cu<'2+>、Fe<'3+>、Fe<'2+>加速底物酶促反应；采后龙眼果实经活性氧自由基处理，随贮藏期的延长膜脂过氧化加剧、酶促褐变反应加速、龙眼果皮褐变底物(-)-表儿茶素含量明显低于未处理果，室温贮藏初期，?OH处理果果皮中(-)-表儿茶素含量明显高于O<,2>和H<,2>O<,2>处理果及未处理果，贮藏末期三种活性氧自由基处理果差异不大。经抗氧化剂(即抗褐变剂)处理，龙眼果皮褐变底物(-)-表儿茶素含量显著高于未处理果，推测外源抗氧化剂除显著抑制龙眼PPO活性外，还可减缓膜脂过氧化作用，一定程度上抑制了(-)-表儿茶素的酶促反应，延缓果皮褐变。4氧化聚合产物的组成、结构特征与果实贮藏期间其变化情况：利用高效液相色谱、三维荧光光谱分析确定类脂褐素是龙眼果皮中PPO底物的氧化褐变产物，褐变底物的氧化产物参与了类脂褐素的积累，龙眼果皮褐变指数与类脂褐素含量增加呈线性正相关，表明类脂褐素是龙眼果皮褐变的产物。龙眼果实在贮藏期间，随贮藏时间延长、果皮褐变指数增加、褐变底物含量减少，果皮中氧化聚合产物类脂褐素逐渐积累。阐明龙眼采后酶促褐变化学机理：由于采后细胞区域化结构逐步丧失，单酚加氧酶、酪氨酸酶、二元酚氧化酶、多酚氧化酶、漆酶等在有氧条件下，将龙眼酚类底物氧化为醌，醌有非常高的反应活性，能通过自身聚合或与其它酚类、氨基酸、蛋白质、脂类等发生非酶促反应，生成结构不定的褐色物质，其中包括带Shiff-base结构的复合物，被认为是类脂褐素的一类。不同品种龙眼果皮中褐变底物含量的差异通过比较采后褐变难易程度不同的广西主栽龙眼品种“石硖”、“储良”、“大乌圆”低温贮藏(4℃)28天期间果皮褐变指数、主要褐变底物含量、褐变相关酶活性的差异发现贮藏过程中，“储良”、“大乌圆”果皮发生酶促褐变反应严重，反应消耗底物较多，其含量较低。该分析方法为判定广西不同龙眼品种的采后抗褐变程度差异，为耐贮品种的选育提供理论依据。社会经济效益，存在的问题：社会经济效益：该成果的实施推动了龙眼采后保鲜产业的发展，具有良好的社会经济效益。存在的问题：由于中国龙眼种植主要以个体农民种植为主，即使在主产区，面积很大的龙眼园虽颇为壮观，但实际上基本是“大群体，小单位”的生产体制，组织化程度低制约了该研究成果如龙眼采后处理技术的贯彻。历年获奖情况：无。 |
