地区：上海市 宝山区
关键词：广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000003925
成果描述：
| 课题来源与背景：褐飞虱Brownrice planthopper (Nilaparvata lugens(Stal))，别名：褐稻虱，属同翅目飞虱科具远距离迁飞习性，是中国和许多亚洲国家水稻上的首要害虫，每年造成的农业损失达数亿元。该害虫的预测预报与综合防治在生产中尤其重要。在全球气候变暖的大背景下，极端高温天气频繁出现，这给农业上预测预报该害虫发生情况产生了很大的影响。研究褐飞虱对高温的耐受性及其机理的影响已迫在眉睫。已有的研究结果表明，有机体对外界环境刺激的反应同体内功能基因翻译、转录和表达密切相关，昆虫对高温胁迫反应也不例外。高温对于昆虫的具体影响从表观上观察还无从得知，因此，研究高温对昆虫体内遗传基因的影响是人们了解昆虫应对胁迫机理机制的一个很好的方法。近年来，科研工作者们已经发现一些与昆虫热胁迫响应相关的基因，如热激蛋白基因，褐飞虱体内也已经发现了两种hsp70和hsp90，但这些基因在褐飞虱体内对热胁迫的功能和特征还未进行研究，热胁迫下褐飞虱体内最稳定的内参基因的研究更未见报道。因此，该发明成果的初衷是探究在褐飞虱受到热胁迫和非胁迫下最稳定表达的内参基因，解决了褐飞虱在不同高温胁迫下合适的内参基因选择问题。该发明成果以未受胁迫的褐飞虱为对照材料，不同高温胁迫后的褐飞虱为实验材料进行荧光定量PCR研究；各候选内参基因定量PCR数据输入geNorm和BestKeeper软件进行分析，从而筛选出在高温胁迫和非胁迫下褐飞虱体内最合适、最稳定表达的内参基因。并以高温胁迫后的褐飞虱为样本，以褐飞虱热激蛋白基因hsp90基因为例，采用筛选出的内参基因研究了在高温胁迫下褐飞虱hsp90基因的表达规律，以验证该发明。技术原理及性能指标：该发明成果所述的一种高温胁迫下褐飞虱成虫内参基因的筛选方法及应用主要采用如下方案进行：野外采集褐飞虱材料，在室内同一条件饲养至2-3代，采用成虫进行不同高温胁迫。高温胁迫后室温恢复1小时。胁迫处理后的个体立即提取总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和微量紫外分光光度计测定浓度和质量。反转录成cDNA，-20℃保存备用。以未胁迫处理的虫体为对照材料进行相同操作。采用primer 5.0软件设计合成褐飞虱内参基因特异性实时荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性及按10倍梯度稀释cDNA分别进行定量PCR建立标准曲线，根据标准曲线斜率确立每对引物的扩增效率（E），E=10-1/斜率-1，斜率由定量仪器自带软件给出。分别以候选内参基因为引物，对各处理进行荧光定量PCR分析，数据输入输入geNorm和BestKeeper软件进行分析，从而筛选出在高温胁迫和非胁迫下褐飞虱体内最合适、最稳定表达的内参基因。以高温30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃分别胁迫1小时的褐飞虱雌、雄虫为样本，以筛选出的基因为内参，实时荧光定量PCR检测褐飞虱hsp90基因在各个胁迫处理下的表达规律。该发明成果所述褐飞虱饲养条件为：温度25℃，湿度75±5%，光照周期黑暗：光照=10小时：14小时，新鲜水稻饲养；热胁迫处理条件为：30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃高温下分别处理1小时和2小时，然后室温（25℃）恢复1小时，雌、雄虫分别处理，虫态均为成虫。该发明成果所述反转录合成cDNA的模板用量为1μg总RNA，荧光定量PCR反应程序为：95℃ 30S，接下来95℃ 10S， 60℃ 30S ，荧光信号手收集，共40个循环，循环结束后绘制溶解曲线：55℃-95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。每个处理均设3个生物学重复，定量PCR设3个重复孔。技术的创造性与先进性：该发明成果利用荧光定量PCR技术，建立筛选出在不同高温胁迫和非胁迫下褐飞虱体内稳定表达的内参基因的方法，于为下一步研究水稻重要害虫褐飞虱在高温胁迫下相关基因的表达与功能研究奠定基础。技术的成熟程度，适用范围和安全性：该技术较为成熟，使用过程中无安全隐患。应用情况及存在的问题：已在褐飞虱耐热性相关研究中应用，效果较好，不存在问题。 |
