地区：上海市 宝山区
关键词：中农威特生物科技股份有限公司
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000003375
成果描述：
| 研究目的与意义: 动物细胞大规模悬浮培养是生物技术制药产业广泛采用的技术平台，生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等。在大规模工业化生产中BHK21细胞的培养方式有两种，即悬浮培养和固定化培养，一般而言，悬浮培养操作简便、培养规模易于放大但单位培养体积的产率低、投资强度大；固定化培养的特点则正好与其相反。BHK21细胞悬浮培养株是将固定化培养的BHK21细胞经悬浮适应驯化，从原来贴壁生长细胞经过长时间的筛选和诱导获得悬浮适应的细胞株。细胞在悬浮条件下培养，意味着细胞原生长的微环境发生了改变，胞外基质被剥夺，细胞就会发生凋亡，这种凋亡的形式由于使细胞脱离了原来的生活微环境，因而被称为失巢凋亡。可见悬浮培养方式进一步增大了BHK21细胞发生凋亡的比例和几率；另外，细胞在大规模生物反应器培养过程中，灌流培养的细胞生产周期较长，如果细胞以较高的速度持续不断的生长增殖，很快就会达到生物反应器的容量上限。由于体外培养的细胞接触抑制机制较弱，过于拥挤的细胞仍然会生长分裂，最终导致细胞凋亡。一旦细胞凋亡启动，死亡细胞的内容物释放到培养基中，会进一步引起其它细胞的死亡，导致产品质量下降，生产进入下降期；此外，在细胞培养中，血清的缺乏、氨和乳酸等有害代谢产物的积累、氧自由基或溶氧过低、酸性pH环境、营养缺乏等多种因素都可诱导细胞凋亡的发生。由此可见，对于作为现代生物制药产业主要技术平台的动物细胞大规模悬浮培养而言，维持细胞在高密度培养时的细胞活性、抑制细胞凋亡成为众多研究者提高细胞质量、改进细胞培养工艺的热点。主要论点、论据: 通过分析考察运用生物反应器进行动物细胞大规模悬浮培养中可引起细胞凋亡的各种因素，寻找凋亡诱因，力求从细胞本质出发，应用基因工程技术手段，构建能过量且稳定表达Bcl-2基因的重组细胞株，设计并合成针对LDH-A基因的shRNA表达单元，并将它稳定整合至BHK21细胞，使其持续高表达，降低LDH-A基因的mRNA水平，以达到减少乳酸积累，改善细胞生长状态的目的。该研究构建的BHK21重组细胞株增强了对凋亡诱导因素的抵抗力，降低了细胞凋亡水平，从而提高了细胞活性，延长了培养周期，增加了培养细胞的密度和产物浓度。创见与创新: 在国内首次实现了BHK21细胞抗凋亡基因的过表达，及应用RNA干扰技术降低了乳酸的低水平表达。项目实施结果的经济、社会效益分析: 研究采用生化工程技术手段和分子生物学的技术方法，通过改造BHK21细胞基因组结构，控制其表达，可有效地消除或减轻细胞凋亡诱因、阻断细胞凋亡信号传导途径，赋予动物细胞抵御环境压力诱导的凋亡的能力,提高大规模培养中的细胞活力、延长细胞在规模培养过程中的有效培养时相，实现动物细胞的大规模高密度培养，从而提高细胞生产有价值生物技术产品的能力。另外，通过改造细胞结构抑制细胞凋亡，在工业化生产中不但优化了细胞培养工艺，使得大规模动物细胞培养技术更加成熟，且提高了操作单元的生产效率，节省了下游产品纯化的成本，产品的产量有可能提高2-3倍，从而产生巨大的经济效益和社会效益。 |
