地区：上海市 宝山区
关键词：华南理工大学;暨南大学;广州海莎生物科技有限公司;东莞泛亚太生物科技有限公司
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000001606
成果描述：
| 项目实施过程中形成的关键技术与技术创新：建立了基于酵母展示技术的高通量酶分子筛选：基于酵母展示技术构建了酶定向进化与催化耦联化的技术平台，应用于南极假丝酵母脂肪酶和米黑根毛霉脂肪酶耐热稳定性的改造，通过脂肪酶的分子改造获得两个有效的突变子，获得米黑根毛霉脂肪酶突变子RML66最适反应温度由50℃提高到60℃;以及南极假丝酵母脂肪酶突变子CALB在70℃的热稳定性提高了将近1倍。将耐热毕赤酵母展示脂肪酶应用于酯类物质的合成，60℃反应6小时转化率达98%，有效缩短了反应时间，提高了合成效率。构建了工业酶高效分泌表达和展示体系：毕赤酵母展示体系构建及在固定化酶的应用:充分发挥酵母展示体系的颗粒化和固定化的特点，以脂肪酶为对象研究毕赤酵母展示脂肪酶高效表达体系。研究酶蛋白的高效表达技术，重点建立具有自主知识产权毕赤酵母和丝状真菌表达体系，以内质网蛋白加工与分析技术为基础研究酶蛋白的分泌性、外源蛋白与宿主细胞的相互作用的影响等关键问题，有效提高工程真菌外源酶蛋白的表达水平。完成油脂生物制造用的特异性3种脂肪酶，包括:南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、米黑根毛霉脂肪酶(RML)以及疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的毕赤酵母展示表达菌株的构建。黑曲霉外源蛋白表达系统的构建:通过筛选启动子、筛选标记、终止子等构建重组蛋白的基础米曲霉表达载体，并考察其作为重组蛋白基因表达载体的基本性质。以酿造工业常用菌株–黑曲霉SH-1作为出发菌株，根据筛选标记的特点构建相应的宿主菌。在优化各种表达元件的基础上实现外源蛋白在米曲霉中的高效表达。通过EGFP与米曲霉内源蛋白基因的融合表达、RNAi、基因敲除等技术研究米曲霉的蛋白分泌途径，探索影响重组蛋白有效分泌的因素，实现重组蛋白的高效分泌表达，并应用于磷脂酶(PLA2)和脂肪酶(RML)的表达试验。完成了细胞展示脂肪酶的中试及吨级发酵生产试验：研究结果表明毕赤酵母展示脂肪酶CALB、TLL和RML最大酶活力分别达到3500U/g、2100U/g和150U/g，其中展示该脂肪酶TLL和RML的Sn-1,3位选择性均>90%，毕赤酵母展示脂肪酶CALB完成吨级发酵生产示范，达国内领先。此外，通过从头构建开发食品级黑曲霉细胞展示菌株生产CALB脂肪酶，利用组成型启动子的体系，解除了低葡萄糖对细胞裂解引起的不稳定性因素对发酵的影响，使单位产酶水平达到1200U/g的水平。高效的展示固体化脂酶催化反应体系构建与优化：以酵母和黑曲霉展示固定化脂肪酶为催化剂，针对磷脂改性和结构磷脂制备、油脂精炼过程和油脂改性过程，进行酶催化反应工艺路线设计及反应条件优化。包括：展示固体化脂酶催化剂预处理方式，展示固体化脂酶催化添加量、展示酶预处理记忆pH、反应温度、搅拌速度、水除去方式等对催化效率（反应区域选择性与转化率）和展示酶稳定性的影响，通过比较一步催化与分步催化转化效率，确定最适生物合成转化工艺及参数。展示固体化脂酶催化绿色生产工艺放大和固体化脂酶的工业应用评价：建立展示固体化脂酶催化分批或补料批式反应工艺模式。在构建展示固体化脂酶催化催化酯化、转酯的合成体系和确定反应参数的基础上，根据工艺要求设计和制备展示固体化脂酶催化分批反应装置，研究分批转酯、酯化反应过程的参数变化规律，建立分批反应动力学模型。完成展示固体化脂酶生物催化转化中试放大工艺。在保持展示固体化酶催化合成体系稳定的条件下，利用低温真空蒸发或分子筛吸附控制反应水分，提高生产效率，降低成本。探索一套工业化可行、无毒性溶剂的非水相展示固体化酶催化转化生产体系，建立适合工业化规模的生物转化绿色生产工艺。推广展示固体化脂酶催化绿色生产工艺应用于酶法磷脂改性和结构磷脂制造、油脂精炼过程以及油脂改性的生产过程中，完成2-3种专用磷脂、油脂产品和油脂精炼过程（脱胶、脱酸）生产示范。展示固体化脂酶应用于溶血磷脂和结构磷脂的工业化规模生产：酶法水解改性大豆卵磷脂制造技术：在自行设计的新型鼓泡式酶反应器中，食品级大豆卵磷脂在脂肪酶或者磷脂酶A2或者A1催化下水解，水解液通过薄膜蒸发干燥脱水，再经过调质，加入其他不同HLB值的食品乳化剂产品，复配成不同规格的溶血磷脂产品。部分客户需要低酸值的溶血磷脂产品，由于产品流动性好，可以采用分子蒸馏技术除去部分脂肪酸，降低产品的酸值。完成年产2000吨溶血磷脂产品生产线示范。酶法酯交换改性制造结构磷脂制造技术：大豆卵磷脂通过己烷溶解制成磷脂溶液，磷脂溶液和多不饱和脂肪酸（EPA或DHA）在磷脂酶A1或脂肪酶的催化下在固定床或者鼓泡式反应器中进行酯交换反应。反应液通过闪蒸回收溶剂，剩余溶剂通过流化床干燥回收，得到粉末中间产品。中间产品通过丙酮萃取酯交换反应释放出的脂肪酸，分离脂肪酸和结构磷脂，得到结构磷脂产品。原料大豆卵磷脂可以采用磷脂酰胆碱不同含量的产品，如15%、35%、50%和90%系列产品四个。完成年产500吨富含多不饱和脂肪酸的结构磷脂系列产品产品生产线示范。 |
