地区：上海市 宝山区
关键词：广西壮族自治区水牛研究所
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000005808
成果描述：
| 任务来源：该课题属于2010年度广西自然基金面上项目：高效基因定点整合技术及其在水牛体细胞转基因的研究（合同编号：2010GXNSFA013096），实施时间2010年3月至2013年3月，由广西壮族自治区水牛研究所组织实施，主持人为庞春英，参加单位为佛山科学技术学院。研究背景与意义：奶水牛是中国南方地区重要的经济畜种，其乳脂为7-8%，乳蛋白在4-6%之间，1kg水牛奶相当于1.45kg的标准奶，号称“奶中之王”。尽管水牛乳乳脂含量高，但大多数是饱和脂肪酸。研究发现进食大量的饱和脂肪酸后肝脏的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的活性增高，使胆固醇合成增加，对人体健康不利。同时，大量流行病学资料显示，饮食中ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）比例过高与某些疾病的高发密切相关，如：冠心病、糖尿病、乳腺癌等。但哺乳动物中由于缺乏△12和△15去饱和酶，所以无法自主合成ω-6和ω-3PUFAs，同时导致ω-6和ω-3PUFAs在动物体内的转化途径相对独立，两者之间无法相互转化，这对于ω-6和ω-3PUFAs的动态平衡是不利的。因此，如何调节机体ω-6/ω-3 PUFAs的平衡成为脂肪酸研究领域的热点内容之一。为此，该课题拟研发水牛多位点基因打靶技术，在水牛体细胞中定点整合Fat-1基因，为今后培育具有乳腺特异性表达Fat-1转基因水牛奠定基础，这不仅有利于改善水牛乳品质，提高其附加值，推动水牛产业发展，也可以成为研究高等哺乳动物中高不饱和脂肪酸代谢途径和探讨哺乳动物核质关系的良好模型，具有重要的理论价值和科学指导意义。主要成果：成功克隆了水牛rRNA基因（GenBanknumber：JN412502），为下一步水牛多位点基因打靶载体的构建以及建立水牛多位点基因打靶技术提供了理论基础；构建了水牛多位点乳腺特异性表载体pBC1-DS1-Fat1-EGFP-DS2（载体容量达27kb），率先获得了一套大容量真核表达载体构建技术，为今后构建水牛乳腺生物反应器所需的表达载体等提供了技术支撑；获得了转Fat-1基因水牛肾脏成纤维细胞，经连续培养、RT-PCR和测序验证表明Fat-1基因在水牛肾脏成纤维细胞中获得了稳定表达，为随后的体细胞核移植获得转基因水牛提供了核供体；结合显微注射技术注射水牛多位点乳腺特异性真核表达载体pBC1-DS1-Fat1-EGFP-DS2，成功生产60枚含Fat-1基因的转基因水牛胚胎，经胚胎移植受体母水牛4头，1头成功受孕待产。成果的创造性和先进性：该课题的成功实施，不仅有利于提高中国水牛转基因技术研究水平，也可以成为研究高等哺乳动物中高不饱和脂肪酸代谢途径和探讨哺乳动物核质关系的良好模型，为转基因水牛的研究和今后搭建水牛乳腺生物反应器提供技术支撑，取得如下创新性成果：首次应用LA PCR技术成功克隆了水牛rRNA基因（GenBank number：JN412502），为下一步水牛多位点基因打靶载体的构建以及建立水牛多位点基因打靶技术提供了理论基础；通过构建了水牛多位点乳腺特异性表载体pBC1-DS1-Fat1-EGFP-DS2（载体容量达27kb），率先获得了一套大容量真核表达载体构建技术，为今后构建水牛乳腺生物反应器所需的表达载体等提供了技术支撑；国际上首次构建了水牛多位点基因打靶技术，在水牛上探究了定点整合外源基因的可行性。同时，转Fat-1基因水牛肾脏成纤维细胞的成功获得，为随后的体细胞核移植获得转基因水牛提供了核供体。该研究成果在水牛转基因定点整合研究领域填补了国内空白，这不仅是水牛育种科学上的又一突破，也有利于今后搭建水牛乳腺生物反应器，提高水牛乳附加值，促进水牛产业发展，其的巨大的经济前景不可估量。作用意义：该成果属于基础研究，没有直接的经济效益，重点研发技术。基于水牛多位点基因打靶技术，构建乳腺特异性表达Fat-1基因的克隆水牛，不仅可以改善水牛乳乳品质，提高水牛乳附加值，促进水牛产业发展，而且也可以成为研究高等哺乳动物中高不饱和脂肪酸代谢途径和探讨哺乳动物核质关系的良好模型，其间接经济效益和社会效益巨大。存在问题及建议：该成果中涉及的水牛乳腺特异性表达载体容量过大、没有添加抗性基因进行筛选以及较低的同源重组效率等3个因素，是造成水牛多位点基因打靶技术打靶效率依然偏低的原因。故，基于前期的研究结果，建议集成ZFN、TALEN或Cas9技术，构建定点修饰酶诱导的水牛多位点基因打靶技术，以提高外源基因的定点整合效率。该技术已在其他物种（比如，小鼠、大鼠、斑马鱼和桂花鱼等）得到了验证，是可行的。 |
