地区：上海市 宝山区
关键词：潍坊医学院
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000004977
成果描述：
| 该项目来源于山东省科技发展计划等基金项目，属于实验诊断学、免疫生物化学及基因工程交叉学科的应用基础研究。免疫诊断是疾病诊断的重要辅助技术，随着检测模式的进展及疾病标志物的发现，免疫诊断在临床诊断中的地位愈显重要。抗体抗原特异性结合是免疫诊断的应用基础，与几乎穷尽体系中检测信号的新型检测技术相比较，抗体的标记、固定技术相对滞后，尽管连接抗体分子内氨基酸残基的化学共价偶联法能有效地标记或固定抗体，但偶联后抗体活性不均一甚至失去抗原结合能力，严重影响免疫诊断的特异性与灵敏度。该项目基于ZZ亲和肽与IgG抗体Fc段的生物亲和特性，针对免疫诊断技术中抗体标记及固定的关键技术问题，以ZZ亲和肽为关键构件，通过基因工程技术构建系列重组蛋白，建立了生物亲和连接的新型“绿色”抗体标记与固定技术，抗体的生物活性由此不会因标记或固定而受到影响，切实提高了免疫分析的灵敏度及特异性。1．建立了Fc位点专一性连接的抗体生物学标记技术①以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、碱性磷酸酶(AP)为标记物，通过ZZ-EGFP、ZZ-AP重组蛋白介导抗体的荧光、酶生物学标记，并应用于抗核、肺炎支原体IgG的荧光诊断及TORCH的West blot诊断。②以生物素为标记物，BirA-Avitag技术完成ZZ-Avitag及AP-(Avitag)2重组蛋白Avitag位点的生物素标记，利用亲和素-生物素亲和作用实现AP与抗体的间接生物学标记，建立了一种生物素化抗体、酶均由生物方式定量标记的新型亲和素-生物素技术体系并应用于ELISA诊断。上述研究实现了标记物(荧光、酶及生物素)以生物方式特异性地定量连接在IgG抗体Fc段，较共价偶联技术相比，检测灵敏度提高20-30倍，从设计思路、方法上突破了化学共价随机偶联技术的局限性。2．建立了Fab位点暴露展示的抗体立体定向固定技术利用Histag与金属离子、PStag与聚苯乙烯(PS)、Cys(半胱氨酸)与马来酰亚胺的结合特性，在PS微孔板表面改性引入活性基团，通过ZZ-Histag、ZZ-PStag及Z-Cystag重组蛋白，创造性地将ZZ重组蛋白分别牢固地定向连接于PS表面，继而结合抗体Fc段，建立Fab位点暴露展示的抗体立体定向固定技术。所构建三维固相化抗体应用于ELISA，检测灵敏度较物理、化学包被技术提高30-50倍，为抗体芯片等其他固相免疫分析的抗体固定方法开辟了新思路。3.建立了高效便捷的EGFP筛选标记的原核体系重组体筛选技术构建了EGFP-active、EGFP-inactive型pUC18改型载体，率先将EGFP作为筛选标记应用于原核表达体系，拓展了EGFP的应用范围。通过ZZ肽系列重组体筛选的验证，结果确凿，且筛选无需添加诱导、显色物质，较LacZ蓝/白斑方案便捷、高效。该项目经山东省科技厅成果鉴定，技术水平达到国内领先。申报国家发明专利5项，已获授权3项，发表论文39篇(SCI收录22篇，IF总计52分)。附件10篇SCI论文IF总计31.4分，累计引用58频次。基于该项目获省大学生生化实验技能大赛一等奖1项，指导青年教师2名，培养硕士研究生6名。项目技术通过多种形式应用于省内多家科研医疗单位的人才培养、基础研究及免疫诊断中，应用效果和社会效益显著，一致认为项目具有很高的产业化价值与前景。 |
