地区：上海市 宝山区
关键词：台州市立医院
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000001660
成果描述：
| 为明确Syk(L)对喉癌生长的影响，该项目通过免疫组织化学法检测喉鳞状细胞癌组织Syk（L）蛋白表达情况，并分析其表达与喉鳞状细胞癌T分期、病理组织学分级、颈淋巴结转移等临床病理参数的相关性，从临床角度初步探讨Syk（L）在喉癌生长中的可能性作用；通过构建pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒，并将其转染喉癌hep-2细胞系，利用CCk-8实验、细胞侵袭及迁移实验观察其转染细胞的生长、侵袭及运动能力，从体外角度验证Syk（L）在喉癌细胞生长中的作用；通过建立裸鼠喉癌hep-2细胞移植瘤模型，利用pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒转染裸鼠成瘤实验、裸鼠移植瘤的治疗实验，从体内角度进一步验证Syk（L）在喉癌细胞生长中的作用。从而全面的阐明了Syk(L)对喉癌细胞生长的抑制作用，为Syk(L)成为喉鳞癌基因治疗作用新靶点提供了实验依据及奠定了理论基础。主要研究内容1.喉鳞癌组织Syk（L）蛋白表达与喉鳞癌生长关系的临床研究。利用免疫组织化学法检测48例喉鳞癌患者的喉癌组织中SYK（L）蛋白的表达，以声带不典型增生组织和正常喉粘膜组织作为对照，并分析其与喉癌T分期、病理组织学分级、颈淋巴结转移等临床病理参数的相关性，为进行Syk (L))对喉癌生长影响的实验研究提供临床基础与前提。2.pIRES2-EGFP-SyK（L)重组质粒构建及稳定转染喉癌Hep-2细胞株的建立。人工合成Syk(L)基因序列并装入pMD18-simpleT载体中，将验证正确的Syk(L)基因基因序列克隆到pIRES2-EGFP载体中，构建pIRES2-EGFP- Syk(L)表达质粒载体。体外培养喉癌hep-2细胞，利用脂质体转染法将pIRES2-EGFP- Syk(L)载体转染染喉癌hep-2细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的Syk(L)高表达的喉癌hep-2细胞模型，为进一步研究Syk(L)在喉癌发生、发展中的生物作用奠定前期基础。3.pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒转染对喉癌hep-2细胞生长抑制的体外研究。用CCK-8法分析pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒转染后喉癌hep-2细胞体外增殖能力变化；构建侵袭小室，采用侵袭实验、迁移运动实验测定细胞转染后的体外侵袭及趋向运动能力；逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组sykmRNA变化、蛋白印迹法检测喉癌细胞Syk蛋白变化。体外探讨Syk(L)重组质粒转染对喉癌细胞生长的影响，为pIRES2-EGFP- Syk(L)体内应用治疗喉癌提供体外实验依据。4.pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒对裸鼠喉癌hep-2细胞移植瘤生长的抑制作用。利用喉癌hep-2细胞转染裸鼠成瘤实验、裸鼠喉癌hep-2细胞移植瘤pIRES2-EGFP-Syk(L)重组质粒治疗实验，通过测量肿瘤体积变化、绘制肿瘤生长变化曲线、测量肿瘤质量，通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织sykmRNA变化、蛋白印迹法检测肿瘤组织Syk蛋白变化，探讨pIRES2-EGFP-Syk(L)质粒转染对喉癌hep-2细胞裸鼠体内成瘤能力及裸鼠喉癌hep-2细胞移植瘤生长能力的影响，从体内角度明确Syk(L)重组质粒对喉癌细胞生长的抑制作用，为pIRES2-EGFP- Syk(L)质粒人体内应用治疗喉癌提供动物实验依据。获得成果1.发现喉鳞癌组织中yk (L)蛋白表达降低，其低表达与喉癌T分期、病理组织学分级及淋巴结转移明显相关，从临床角度证实提示Syk (L))蛋白对喉癌的发生、发展起抑制作用，为从实验角度进一步明确Syk (L))抑制喉癌生长提供了前期基础。2.成功构建新型荧光蛋白标记pIRES2-EGFP- Syk(L)表达质粒载体，并稳定高效转染喉癌hep-2细胞，为深入研究Syk(L)的对喉癌细胞生物功能的影响奠定实验基础。3.Syk(L)显著抑制喉癌增殖、侵袭及迁移能力；Syk（L）转染可降低喉癌hep-2细胞裸鼠成瘤能力及裸鼠移植瘤生长能力，其体内使用安全性高Syk(L)显著抑制喉癌增殖、侵袭及迁移能力。从体内外角度全面的、多层次的验证及阐明了Syk（L）对喉癌细胞生长具有抑制作用，为Syk(L)成为喉鳞癌基因治疗作用新靶点提供了实验依据及奠定了理论基础。4.发表论著５篇，其中SCI论文一篇、中华级一级论文一篇、其它一级论文2篇、二级论文1篇，具体如下1）Full-length spleen tyrosine kinase inhibits the invasion and Met-astasis of human laryngeal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Patho.2015.8（12）：15786-15793. 2）全长型脾酪氨酸激酶基因转染对喉癌细胞恶性生物学行为的抑制作用.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,49(11):943-949. 3）MS-HRM技术定量检测喉鳞癌syk(L)基因启动子甲基化的方法及意义.中国卫生检验杂志，2014，24(23):3440-3446. 4）pIRES2-EGFP-syk(L)载体构建及稳定转染喉癌Hep-2细胞株的建立.中国卫生检验杂志,2013,23(13):2718-2721. 5）全长型脾酪氨酸激酶基因转染对人喉鳞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用.医学研究杂志,2015,44(6):65-69. 5.实际参加国内外学术交流3次，具体如下：1）浙江省中西医结合学会耳鼻咽喉科专业委员会第十二次年会；2）浙江省中西医结合学会耳鼻咽喉科专业委员会第十三次年会；3）中华医学会第十一次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议。创新点1.发现喉鳞癌组织中Syk蛋白亚型Syk (L)（具有潜在抑癌基因功能）表达降低，其低表达与喉癌T分期、病理组织学分级及淋巴结转移明显相关，从临床角度证实提示Syk (L))蛋白对喉癌的发生、发展起抑制作用，为从实验角度进一步明确Syk (L))抑制喉癌生长提供了前期基础。2.创建新型荧光蛋白标记pIRES2-EGFP- Syk(L)重组质粒表达载体，该重组质粒具有转染过程操作简便、省时经济、运用面广、包容性强、细胞毒性小及检测方便直观等特点，有利于Syk(L)对喉癌生物活性影响的研究。3.通过体内外实验双重角度证实Syk(L)对喉癌生长的抑制作用及其重组质粒体内使用的安全性，为Syk(L)作为喉癌基因治疗作用新靶点及应用价值提供了更有力的实验依据及理论基础。 |
